10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液
|
產(chǎn)品編號
|
產(chǎn)品名稱
|
規(guī)格
|
|
BC600P
|
10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液（粉末）
|
1升
|
● 簡介：
10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖適用于BN蛋白電泳后凝膠上非變性蛋白的轉(zhuǎn)膜。本轉(zhuǎn)膜液配制便捷，稀釋后無需調(diào)節(jié)pH值，pH約為7.5-7.7。該緩沖液最終可配成10升即用型1×緩沖液（根據(jù)需求補加甲醇）。
● 貯存、運輸及效期：
粉末裝常溫保存，常溫運輸，兩年有效；配成10×轉(zhuǎn)膜緩沖液后4℃貯存，一年有效；加入甲醇的即用型轉(zhuǎn)膜緩沖液4℃貯存，一個月有效。
● 配制方法：
將10×轉(zhuǎn)膜緩沖液粉末全部溶解于1升超純水中，徹底溶解，即配成10×轉(zhuǎn)膜緩沖液。
根據(jù)下表配制成1×即用型轉(zhuǎn)膜緩沖液
|
|
1×即用型轉(zhuǎn)膜緩沖液
|
|
|
500 ml
|
1 L
|
2 L
|
|
10×轉(zhuǎn)膜緩沖液
|
50 ml
|
100 ml
|
200 ml
|
|
超純水
|
約300 ml
|
約600 ml
|
約1200 ml
|
|
無水甲醇
|
甲醇終濃度0-20%
|
|
超純水
|
定容至 500 ml
|
定容至 1升
|
定容至 2升
|
|
|
不要調(diào)節(jié)pH
|
注：轉(zhuǎn)膜緩沖液中加入甲醇對蛋白有固定作用，轉(zhuǎn)膜分子量較大的蛋白少加或不加甲醇，轉(zhuǎn)膜分子量較小的蛋白要加至多20%的甲醇；為確保轉(zhuǎn)膜效果，轉(zhuǎn)膜緩沖液不建議重復使用。
● 使用方法：
1. BN電泳介紹：
BN電泳可以選擇Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒（貨號：RTD6139-0312或RTD6139-0416）。
2. 電泳后凝膠預處理（可選步驟）：
凝膠浸泡于適量1×即用型BN轉(zhuǎn)膜緩沖液（加終濃度0.1% SDS）中，搖床慢搖10分鐘。
注：凝膠浸泡在含SDS緩沖液中，能讓蛋白帶上更多的負電荷，有利于蛋白的轉(zhuǎn)膜。
3. 轉(zhuǎn)膜：
3.1轉(zhuǎn)膜方法：BN電泳后的轉(zhuǎn)膜建議用濕轉(zhuǎn)法。
3.2膜的選擇：BN電泳轉(zhuǎn)膜必須使用PVDF膜，不能用NC膜（NC膜會與考馬斯亮藍G-250不可逆結(jié)合，很難清除干凈）。根據(jù)蛋白大小選擇膜的孔徑。一般說來，大于20 kD蛋白選擇0.45 μm孔徑，低于20 kD選擇0.22 μm孔徑。PVDF膜使用前要用無水甲醇潤濕活化。
3.3 三明治結(jié)構(gòu)：轉(zhuǎn)膜三明治結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)膜相同，即根據(jù)“黑膠白膜”制作三明治，即膜置于轉(zhuǎn)膜夾芯正極一側(cè)，凝膠置于轉(zhuǎn)膜夾芯負極一側(cè)，這樣凝膠上帶負電荷的蛋白才能轉(zhuǎn)移到膜上。
蛋白轉(zhuǎn)膜三明治制作：
負極（電轉(zhuǎn)夾黑色面）-海綿墊-1層1 mm厚度濾紙-凝膠-膜-1層1 mm厚度濾紙-海綿墊-正
極（電轉(zhuǎn)夾白色面）
3.4 轉(zhuǎn)膜條件：
由于在非變性條件下，不同蛋白的空間結(jié)構(gòu)，聚合狀態(tài)，電荷數(shù)量都有不同，以下轉(zhuǎn)膜條件僅供參考，客戶針對自己的目的蛋白，最好經(jīng)過1-2次預實驗后，確定最佳的轉(zhuǎn)膜條件。
|
蛋白大小
|
穩(wěn)流
|
建議時間
|
降溫措施
|
|
低于70kD
|
150 mA
|
1 小時
|
不需要
|
|
70-300 kD
|
200 mA
|
1.5-2 小時
|
需要
|
|
高于300 kD
|
200 mA
|
2.5-3.5 小時
|
需要
|
4. 洗膜：
PVDF膜用無水甲醇清洗10分鐘，徹底去除藍色G250。
5. 進行后續(xù)WB操作：封閉-一抗-二抗-檢測。