2×ligation solution MasterMix
2×DNA連接緩沖液
● 產(chǎn)品組成：
|
貨號(hào)
|
名稱
|
規(guī)格
|
|
RTV701
|
2×ligation solution MasterMix
|
150 μl
|
注；按照10μl連接體系計(jì)算，每次使用5μl，可以使用30次。
● 保存：-20℃
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
2×ligation solution MasterMix是含有T4 DNA Ligase，ligation buffer的2×MasterMix，實(shí)驗(yàn)時(shí)，只需加入片段和載體即可進(jìn)行連接反應(yīng)。
適用于DNA片段和載體DNA的連接以及DNA片段和Linker或Adaptor DNA的連接。
● 注意事項(xiàng)
1．2×ligation solution MasterMix由于含有T4 DNA ligase，使用前冰浴中徹底融化，混勻后使用。
2．為了提高轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化時(shí)建議所加入連接產(chǎn)物的量不要超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的10%。
● 使用方法：
一 DNA片段和載體DNA的連接
1）粘性末端的連接
1．反應(yīng)體系:
|
|
10μl體系
|
終濃度
|
|
線性載體DNA
|
x μl
|
10-50 ng
|
|
插入DNA片段
|
y μl
|
插入片段：載體=1:1-5:1*
|
|
2×ligation solution MasterMix
|
5 μl
|
1×
|
|
ddH2O
|
up to 10 μl
|
|
*：載體與插入片段的摩爾數(shù)比需要優(yōu)化：一般vector:insert在1:1~1:5之間均可得到較好的結(jié)果。用以下公式計(jì)算片段摩爾數(shù)：pmol數(shù)= DNA量(ng)/(660×片段bp數(shù))×1000。例如：插入片段2000bp，線性載體為3000bp，如果載體使用量為50ng（0.025pmol），10μl連接體系中vector:insert的摩爾比是1:3，則需要2000bp pmol數(shù)為0.075pmol，插入片段2000bp的使用量為100ng。
2．徹底輕柔混勻后，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3．反應(yīng)條件：16℃孵育30分鐘。
4．可取5 μl連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化50 μl感受態(tài)細(xì)胞或取1-2 μl連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化50 μl感受態(tài)細(xì)胞。
注：1）若要提高電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)效率，推薦65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘以滅活T4 DNA Ligase后，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒或氯仿抽提對(duì)連接后的DNA片段進(jìn)行純化后進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。
2）若要提高轉(zhuǎn)化子數(shù)目，可將連接時(shí)間延長(zhǎng)至1小時(shí)。
2）平末端的連接
1．反應(yīng)體系:
|
|
10μl體系
|
終濃度
|
|
線性平末端載體DNA*
|
x μl
|
10-50 ng
|
|
插入DNA片段
|
y μl
|
插入片段：載體=1:1-5:1**
|
|
2×ligation solution MasterMix
|
5 μl
|
1×
|
|
ddH2O
|
up to 10 μl
|
|
*：平滑末端的載體與 DNA 片段進(jìn)行連接時(shí)，應(yīng)首先將載體進(jìn)行去磷酸化處理，以防止其自身環(huán)化。
**：載體與插入片段的摩爾數(shù)比需要優(yōu)化：一般vector:insert在1:1~1:5之間均可得到較好的結(jié)果。用以下公式計(jì)算片段摩爾數(shù)：pmol數(shù)= DNA量(ng)/(660×片段bp數(shù))×1000。例如：插入片段2000bp，線性載體為3000bp，如果載體使用量為50ng（0.025pmol），10μl連接體系中vector:insert的摩爾比是1:3，則需要2000bp pmol數(shù)為0.075pmol，插入片段2000bp的使用量為100ng。
2．徹底輕柔混勻后，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3．反應(yīng)條件：16℃孵育30分鐘。
4．可取5 μl連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化50 μl感受態(tài)細(xì)胞或取1-2 μl連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化50 μl感受態(tài)細(xì)胞。
注：1）若要提高電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)效率，推薦65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘以滅活T4 DNA Ligase后，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒或氯仿抽提對(duì)連接后的DNA片段進(jìn)行純化后才能進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。
2）若要提高轉(zhuǎn)化子數(shù)目，可將連接時(shí)間延長(zhǎng)至1小時(shí)。
二 線性DNA的自身環(huán)化
1．反應(yīng)體系:
|
|
10μl體系
|
終濃度
|
|
線性載體DNA
|
x μl
|
10-50 ng
|
|
2×ligation solution MasterMix
|
5 μl
|
1×
|
|
ddH2O
|
up to 10 μl
|
|
2．徹底輕柔混勻后，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3．反應(yīng)條件：16℃孵育30分鐘。
4．可取5 μl連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化50 μl感受態(tài)細(xì)胞或取1-2 μl連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化50 μl感受態(tài)細(xì)胞。
注：1）若要提高電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)效率，推薦65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘滅活T4 DNA Ligase后，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒或氯仿抽提對(duì)連接后的DNA片段進(jìn)行純化后才能進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。
三 接頭連接
1．反應(yīng)體系:
|
|
10μl體系
|
終濃度
|
|
線性DNA
|
x μl
|
100-300 ng
|
|
磷酸化接頭
|
y μl
|
0.5-1 μg
|
|
2×ligation solution MasterMix
|
5 μl
|
1×
|
|
ddH2O
|
up to 10 μl
|
|
2．徹底輕柔混勻后，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3．反應(yīng)條件：16℃孵育30分鐘。
4．65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘滅活T4 DNA Ligase。連接產(chǎn)物可以直接進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)。